репродуктивна медицина

Специализирани процедури при ембриона

При ембриона специализираните процедури се състоят в Time-lapse-култивиране на ембрионите в ембриоскоп, извършване на предимплантационен генетичен тест (PGT),  асистиран хетчинг и криосъхранение.

badge

Култивиране на ембрионите

Ембрионите се култивират в петри с капки хранителна среда, покрити с течен парафин, който ги предпазва от изпарение. Петритата се поставят в инкубатор при температура 370 С, въглероден диоксид 6% и кислород 5%. Култивирането продължава от 2 до 5 дни до завършване на процедурата с eмбриотрансфер или криоконсервиране на получените ембриони.

Оценка на развитието

Стандартният начин за мониторинг и оценка на развитието е като съдът с ембрионите на пациентката се изважда от инкубатора един път дневно сутринта и се поставя на микроскоп.

Извършва се наблюдение на всеки ембрион последователно, като се регистрират различни показатели в зависимост от етапа на развитие, брой клетки, равномерност, фрагментация, компактизация, големина на бластоцистите и др.

TIME LAPSЕ- култивиране в ембриоскоп

Ембриоскопът комбинира в себе си последно поколение инкубатор с вграден микроскоп, камера и специализиран софтуер за мониторинг и анализ на развитието на ембрионите. Той представлява цялостна система, в която ембрионите се развиват и наблюдават без необходимост да се изваждат от инкубатора. Това намалява стреса за ембрионите и е предпоставка за по-доброто им развитие. Условията на култивиране са много добри и се поддържат стабилни през цялото време. Ембриоскопът следи парамери като температура и газове 24 часа, като данните се запазват за всяка пациентка.

Камерата заснема развитието на ембриона на всеки 10 минути в седем различни равнини. За разлика от конвенционалното наблюдение с микроскоп, ембриоскопът позволява да се наблюдава развитието на ембрионите в динамика – как се променя морфологията им във времето с възможност да се анализира развитието, да се проследи деленето и промените детайлно във всеки един момент. Данните от анализа се запазват и могат да бъдат използвани за изграждане на математически модел, който да улесни селекцията на ембрионите с най-висок потенциал за имплантация. Възможността да се подбере подходящият ембрион повишава шансовете за успех.

Биопсия на бластоцисти с цел прилагане на PGT

PGT (предимплантационни генетични тестове) представлява група от генетични методи, които ни дават възможност да анализираме генетичния материал на ембриона още преди имплантирането му, като по този начин се намаляват спонтанните аборти и се избягва прилагането на медицински аборт, ако ембрионът е засегнат. Изследването са прави на стадий бластоциста, като се осъществява биопсия на трофектодермални клетки от нея. Възможностите на PGT включват търсене на определен ген, проверка на броя на една или няколко хромозоми, както и анализ на всички хромозоми. Биопсията се извършва посредством микролазер, монтиран на микроскопите, с който се отрязва малка част от клетките. С помощта на микропипети се отделя материалът за генетичния анализ, след което ембрионът  се замразява до изчакване на резултата. 

Предимплантационен генетичен тест (PGT)

PGT е метод за много ранна генетична диагноза за подбор на здрави инвитро ембриони преди трансфера им в матката и се състои в биопсиране на полярни телца, бластомери или трофектодермални клетки от ембриона, изолиране на ДНК и генетичен анализ. PGT се разделя на три основни групи – PGT-А (preimplantational genetic testing for aneuploidies – предимплантационен генетичен тест за анеуплоидии (неправилен брой хромозоми)); PGТ-SR (preimplantational genetic testing for structural rearrangements) – предимплантационен генетичен тест за структурни хромозомни преустройства; PGT-M (preimplantational genetic testing for monogenic disorders) – предимплантационен генетичен тест за моногенни болести. 

PGT-А се прилага при напреднала репродуктивна възраст на жената, множество спонтанни аборти, неуспешни опити от предходни IVF процедури, тежък мъжки инфертилитет. PGT-SR се прилага в семейства, в които единият и/или двамата родители са носители на структурна хромозомна аномалия – балансирана транслокация, инверсия, дупликация/делеция. Индикации за провеждане на PGT-M имат семейства, в които съществува риск за раждане на болно потомство, тъй като единият или двамата родители са носители/болни от моногенно заболяване. 

 

Провеждането на PGT е оправдано в случаите, когато със сигурност се знае, че заболяването на някой от партньорите при евентуална бременност би довело до мъртво раждане или до летален изход в ранна детска възраст. PGT има смисъл и при пациенти със заболявания с по-голяма продължителност на живота, но с нелечими тежки, множествени, често прогресиращи физически и/или умствени увреждания. Обикновено става дума за редки генетични болести, представляващи животозастрашаващи или хронични инвалидизиращи заболявания без ефективна или със скъпоструваща терапия. В подобни случаи с помощта на PGT е възможно да се подберат и трансферират единствено здрави ембриони. По този начин се избягва здравният риск за жената и психотравмата, които биха възникнали при спонтанно настъпила бременност и необходимостта тя да бъде прекъсната по медицински показания след използване на инвазивна пренатална диагностика (хорионбиопсия, амниоцентеза) и доказване на генетично заболяване при плода.

 

Благодарение на техническия прогрес при асистираната репродукция и геномните технологии PGT има потенциала да се превърне в изключително важно оръжие в борбата ни с генетичните заболявания и ключов подход в превенцията им.

 

Гордеем се, че екипът на Генетичната лаборатория на МБАЛ „Надежда “ е първият в България, който въведе предимплантационната генетична диагностика на ембриони още през 2008г.

В МБАЛ „Надежда” рутинно се провежда предимплантационен генетичен тест на двойки, при които някой от партньорите е с хромозомна аномалия (балансирана структурна транслокация, инверсия или друго хромозомно преустройство; мозаицизъм на някой от партньорите), като екипът ни е с дългогодишен опит.

 

При около 2-4% от двойките с повтарящи се аборти един от партньорите е носител на т.нар. балансирани хромозомни мутации – реципрочни и Робертсонови транслокации, инверсии и др. Такива мутации се наричат фамилни, защото често са унаследени от здрав родител и по-рядко са нововъзникнали. Носителят обикновено е здрав, но определен процент от половите му клетки е с геномен дисбаланс. Такива гамети имат ниска оплодителна способност, водят до липса на имплантация, аборти или до раждане на деца с хромозомни болести. При носителство на хромозомно преустройство рискът от аборт за всяка следваща бременност е висок и варира в зависимост от типа на хромозомната мутация.

 

Тъй като обикновено се тестват всички хромозоми на ембриона, а не само участващите в хромозомното преустройство, е възможно да се докажат и допълнителни мутации по останалите хромозоми.

Индикации за провеждане на този предимплантационен тест имат семейства, в които единият или двамата родители са носители на моногенен дефект за заболявания с различен тип на наследяване: автозомно-рецесивно, автозомно-доминантно, Х-свързано унаследяване (полово-свързано), наследствени ракови синдроми (герминативна мутация).

 

Заболяване с автозомно-рецесивно унаследяване

При двама родители, носители на автозомно-рецесивна мутация, рискът за раждане на болно дете в потомството е 25%. Болести от тази група са бета-таласемия, муковисцидоза, епидермолизис булоза, метаболитни заболявания, спинална мускулна атрофия и др.

 

Заболяване с автозомно-доминантно унаследяване

При този тип унаследяване рискът е 50% за всяко дете. В тази група влизат заболявания като болест на Шарко-Мари-Тут, неврофиброматоза, миотонична дистрофия, хорея на Хънтингтън, остеогенезис имперфекта, фамилна аденоматозна полипоза, ахондроплазия и др.

 

Заболяване с Х-свързано унаследяване (полово-свързано)

В зависимост от типа на унаследяване рискът варира от 25% до 50%. Заболявания в тази група са мускулна дистрофия тип Дюшен, чуплива Х-хромозома, хемофилия, инконтиненцио пигменти, огнищна кожна хипоплазия. Това са болести, при които се засяга само единият пол. Определянето на пола на ембриона дава възможност да се подберат за трансфер само здрави ембриони от незасегнатия пол. Друга възможност за подбор на здрави ембриони е ДНК-анализ за конкретната мутация при налична техническа възможност.

 

В МБАЛ „Надежда“ успешно се извършва предимплантационен генетичен тест за следните моногенни заболявания:

 

  • Мускулна дистрофия тип Дюшен;
  • Хемофилия;
  • Миотонична дистрофия;
  • хорея на Хънтингтън;
  • Чуплива X-хромозома;
  • Епидемолизис булоза;
  • Бета таласемия.

Генетичната лаборатория на МБАЛ „Надежда“ си партнира и с Националната генетична лаборатория (НГЛ), СБАЛАГ „Майчин дом“, за да предложи най-добрата и достъпна възможност за PGT-M на двойките, нуждаещи се от това изследване.

 

Възможностите за провеждане на PGT-M се уточняват след провеждането на медико-генетична консултация със специалистите по Медицинска генетика в МБАЛ „Надежда“.

Индикациите за PGT-А са напреднала репродуктивна възраст на жената, множество спонтанни аборти, неуспешни опити от предходни IVF процедури, тежък мъжки инфертилитет.

 

При PGT-А ембрионите се анализират за броя на всички хромозоми. Приблизително 70% от ембрионите, получени в резултат на естествено оплождане или инвитро процедура, се губят преди раждането. По-голямата част от ембрионите се губят през първия триместър, повечето дори преди имплантацията. Главната причина за това са хромозомните аномалии, известни като анеуплоидии, в резултат на загуба или добавка на хромозоми.

 

Най-малко 85% от анеуплоидиите при ембрионите възникват в яйцеклетката. Спермалните анеуплоидии имат много по-малък дял, възлизащ на около 7-8%. Останалите аберации възникват случайно по време на деленето на клетките в ранния ембрионален стадий.

 

Доказано е, че средно повече от 50% от ембрионите имат хромозомна аномалия. Тъй като този процент нараства с възрастта, това най-вероятно е главната причина, поради която при напредване на възрастта жените забременяват по-трудно и имат по-чести спонтанни аборти. Във връзка с високата честота на хромозомните мутации се вижда и ползата от приложението на PGT-А на ембриони в хода на една инвитро процедура.

 

Някои от хромозомните аномалии позволяват доносване до термин и раждане на живи деца (синдром на Даун, на Едуардс, на Търнър и др.), други водят до преждевременно раждане, спонтанен аборт или спиране на ембрионалното развитие още преди имплантацията.

Прилагането на PGT е възможно само при инвитро оплождане (IVF). Самата PGT инвитро процедура включва хормонална стимулация на яйчниците, извличане на яйцеклетки чрез пункция на фоликулите, вземане на сперматозоиди от партньора, оплождане на яйцеклетките, биопсия на ембриона, провеждане на PGT и трансфер в матката на здравите ембриони.

 

Прилагат се различни техники за биопсия – биопсия на полярно телце, бластомери от тридневни ембриони и трофектодермални ембрионални клетки в стадий бластоциста.

Биопсията се извършва с помощта на лазер, с който се прави малко отворче в обвивката на яйцеклетката, откъдето се изваждат едно или две полярни телца. Процедурата обикновено не оставя отражения върху по-нататъшното развитие на ембриона. Този подход е информативен само за майчини мутации, тъй като не се отчита приносът на бащиния геном, нито  мутации, възникващи след оплождането.

Обикновено при биопсията се вземат една или две клетки на 3-ия ден след оплождането, когато ембрионът се състои от 6-8 бластомера. Проблемът при този подход е съществуването на висок процент на естествен хромозомен мозаицизъм в тридневните ембриони. Възможно е изследваната клетка да е дефектна, а останалите да са нормални, както и обратната ситуация – изследваният бластомер да е нормален, а останалите клетки – дефектни. При PGT-M изолирането и намножаването на ДНК от единична клетка крие риск за ADO (allele drop out – липса на амплификация на единия алел). Това би довело до погрешна диагноза и е причина този подход да намира все по-малко приложение.

Понастоящем това е най-често прилаганият подход. Извършва се на 5-6 ден след оплождането на стадий бластоциста, когато ембрионът има около 100-150 клетки. Бластоцистата представлява мехурче, изградено от два вида клетки. Повърхностните клетки, които обграждат кухината, се наричат трофектодерм и от тях се развива бъдещата плацента. От по-централно разположената група клетки се формира плодът. При биопсията на трофектодерм се вземат 5-7 клетки предшественици на плацентата, при което не се увреждат бъдещите фетални клетки. Предимство на биопсията на трофектодермални клетки е, че анализът на по-голям брой клетки увеличава точността и достоверността на диагнозата и намалява риска от погрешна диагноза вследствие мозаицизъм и ADO.

Извършването на предимплантационни тестове крие минимални рискове за по-нататъшното развитие на ембрионите и яйцеклетките. Рискът за увреждане на яйцеклетката от биопсията е по-малко от 0,2%, а на ембриона – под 1%. Съществува около 5% риск от погрешна диагноза (фалшиво положителна или отрицателна) поради естествения мозаицизъм на ембрионите или технически ограничения на метода. Възможно е да изследването да покаже, че няма наличен нито един нормален ембрион сред изследваните и да не се стигне до трансфер. В част от случаите е възможно резултатите да не е възможно да бъдат интерпретирани.

Успехът от PGT е в пряка зависимост от успеваемостта на IVF клиниките, в този смисъл PGT трябва да се прилага само в най-добрите инвитро клиники след изчерпателна медико-генетична консултация. Във всички случаи при настъпване на бременност се препоръчва инвазивна пренатална диагностика за потвърждаване на резултата от PGT. При деца, родени след PGT-инвитро процедура, не е установена по-висока честота на вродени аномалии.

Понастоящем в МБАЛ „Надежда” се предлага предимплантационен генетичен тест на полярно телце, бластомер и трофектодерм. В зависимост от търсената генетична мутация се прилагат различни техники за анализ. Генетичната лаборатория разполага с апаратура за:

 

  • флуоресцентна ин ситу хибридизация (FISH);
  • микрочипов ДНК анализ (array CGH);
  • ДНК полимеразна верижна реакция (PCR), (PCR в реално време);
  • секвениране от ново поколение (NGS).

Асистиран хетчинг

Някои ембриони притежават по-дебела обвивка. С цел да се подпомогне „излюпването“ и имплантирането им, преди ембриотрансфер с помощта на лазер се извършва изтъняване или отваряне на обвивката на яйцеклетката наречена „зона пелуцида“. Смята се, че при криоконсервация тази зона се втвърдява и затова прилагаме асистиран хетчинг и улесняваме имплантацията.

Криоконсервация на яйцеклетки/ембриони

Използва се за запазване на жизнеспособността на клетките за дълъг период от време. Постига се чрез замразяване и съхранение в течен азот при температура – 196°C. В „Надежда“ използваме най-новия и надежден метод за замразяване –  витрификация. Тя представлява свръхбързо замразяване, при което в контакт с течния азот водата в клетките преминава в стъкловидно състояние, без формиране на ледени кристали. Образуването на кристали е основната причина за загуба на жизненост при замразяване без специални средства и методи. При витрификацията се използват готови разработени среди, заместващи част от водата в клетките с криопротектори, които допълнително предпазват клетките от увреждания. След инкубиране в концентриран разтвор на криопротектор ембрионите/яйцеклетките се поставят в специални сламки и директно се потапят в течен азот.

Методът е надежден и дава много високи резултати – около 95% за преживяемост и развитие след размразяване както при ембрионите, така и при яйцеклетките.

Болница „Надежда“ е ангажирана със съхраняването на репродуктивните възможности при пациенти с онкологични, ревматоидни и авотимунни заболявания в рамките на проект „Запази надежда“.

Вижте още

Специализирани процедури при мъжа
Специализирани процедури при жената
Ембриологична лаборатория
Асистирани репродуктивни техники

Още по темата

scroll-top-custom-arrow